摘 要 以胡桃楸的成熟合子胚為外植體，采用不同消毒方式和培養(yǎng)方式進行組織培養(yǎng)研究，分析了污染率和愈傷組織誘導率。結果表明：紫外線直射15 min滅菌效果最好，污染率及褐化率均最低，分別為15.82%和22.93%;暗培養(yǎng)時間長利于愈傷組織的誘導，以15 d左右為佳。

　　關鍵詞 胡桃楸;外植體;誘導;愈傷組織

　　胡桃楸(Juglans mandshurica)屬胡桃科胡桃屬的落葉喬木，在我國北方地區(qū)是一類果材兼具用珍貴樹種，果實具有很高的食用價值，營養(yǎng)豐富，根莖葉有很高的藥用價值，木材性狀優(yōu)良，在家具等行業(yè)也得到廣泛應用。由此可知胡桃楸的栽植應用前景廣闊。胡桃楸傳統(tǒng)育苗方式主要采取播種繁殖，其種子具有深度休眠的特性，此種繁殖方法存在需要對休眠的種子進行處理且后代無法持續(xù)地將母樹優(yōu)良性狀保存下來等問題，因此，發(fā)展無性繁殖方式優(yōu)越性更加明顯。

　　目前，胡桃楸無性繁殖方式中采取的主要方式是組織培養(yǎng)、扦插等，學者對胡桃楸的扦插[1，2]、組織培養(yǎng)[3，4]方面開展了一系列的研究，相對來說組織培養(yǎng)的優(yōu)勢更加明顯，需要的空間小，不受到時間的限制，具有較大的擴繁系數(shù)，因此，本研究選擇組織培養(yǎng)的方法，外植體選擇成熟的合子胚，經過消毒、培養(yǎng)預處理后進行不定芽萌發(fā)效果的研究，為胡桃楸不定芽誘導植株再生體系的建立、實現(xiàn)育種技術的改良等方面提供一定的基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗地點與材料

　　試驗所需種子采集于遼寧省凌源市青龍河國家自然保護區(qū)，地理坐標為18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，處于凌源市的燕山東段暖溫帶北緣。保護區(qū)主要保護人參、紫椴、黃檗、野大豆等珍稀瀕危野生植物及其生境，保護天然側柏林、天然胡桃楸、天然蒙古櫟林等典型的原生植被和黑鸛、東方白鸛、金雕、大鴇等珍稀瀕危野生動物及其棲息地。

　　青龍河保護區(qū)內胡桃楸天然林面積較大，采集保護區(qū)內胡桃楸優(yōu)良母樹種子，經過晾曬、外皮清理后放在干燥、通風、溫度20～25 ℃條件下備用。在接種前敲碎外殼，將種子尖部的合子胚(帶子葉少量)取出作為外植體用于不定芽的誘導試驗。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 外植體消毒預處理試驗

　　外植體消毒試驗共設6個預處理，分別為：0.2%氯化汞溶液處理5 min、10 min;2%次氯酸鈉溶液處理10 min、15 min;紫外線直射10 min、15 min。預處理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后撈出按照不同的預處理方案實施消毒處理，用無菌水沖洗4～5遍，最后在培養(yǎng)基上接種。所選擇的培養(yǎng)基為改良版的DKW空白培養(yǎng)基，其中每L培養(yǎng)基中另外添加了瓊脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6個處理均設置3次重復，每次重復內有外植體8個。接種后2周進行污染率、褐化率調查統(tǒng)計。

　　1.2.2 外植體培養(yǎng)方法預處理試驗

　　試驗中外植體經過消毒后(選擇1.2.1試驗中效果最好的消毒預處理方式)，轉移到暗環(huán)境中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間共設6個處理，分別為暗培養(yǎng)3、6、9、12、15、18 d。培養(yǎng)基選擇改良后的DKW培養(yǎng)基(每L培養(yǎng)基中另外添加了蔗糖30 g、瓊脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右)，對不同暗培養(yǎng)時間愈傷誘導率進行調查。每個處理3次重復，每個重復內安排10個外植體。

　　按照不同時間處理后，將外植體接種到改良的DKW培養(yǎng)基上進行光培養(yǎng)，在控制溫度25 ℃、光照強度1 500 lx、光照周期為14 h光照10 h黑暗的條件下培養(yǎng)。對培養(yǎng)后不定芽誘導情況進行統(tǒng)計分析。

　　1.3 調查統(tǒng)計方法

　　利用Excel、DPS進行數(shù)據(jù)處理。愈傷組織誘導率(%)=外植體中產生愈傷組織的個數(shù)/外植體接種總個數(shù)×100;不定芽誘導率(%)=外植體中產生不定芽的個數(shù)/外植體接種總個數(shù)×100。各處理取3次重復平均值。

　　2 結果與分析

　　2.1 不同消毒預處理方法對胡桃楸外植體消毒效果的影響

　　植物外植體消毒處理的效果直接影響后期組織培養(yǎng)的效果。本試驗不同消毒預處理方法胡桃楸外植體污染率及褐化率見表1。根據(jù)表1可知，選擇胡桃楸的成熟胚作為外植體，消毒預處理的方法不同，污染率及褐化率表現(xiàn)也不同：0.2%氯化汞溶液處理5 min的污染率最高，達到70.23%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液處理10 min，污染率為47.28%，與0.2%氯化汞溶液處理10 min、2%次氯酸鈉溶液處理15 min的2個處理差異不顯著，但極顯著高于紫外線直射的2個處理;紫外線處理的污染率最低，且隨著直射時間的延長，污染率極顯著降低。根據(jù)表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液處理10 min最高，達到62.12%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液的2個處理，但這2個處理之間差異不顯著;以紫外線直射的褐化率最低，為20%以下，且直射時間越長，褐化率越低。