摘 要：九香蟲(chóng)Coridius chinensis是一種藥食兩用的資源昆蟲(chóng)，溶菌酶是一種能水解細(xì)菌中黏多糖的胞壁質(zhì)酶。本研究克隆了一種九香蟲(chóng)溶菌酶基因CcLys2，其cDNA長(zhǎng)1096 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)672 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼223個(gè)氨基酸(aa)。九香蟲(chóng)溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號(hào)肽，成熟CcLys2是一種分子量為23.34 kDa的分泌型親水蛋白。成熟CcLys2形成7個(gè)α-螺旋和2個(gè)β-折疊片的三維分子結(jié)構(gòu)，并由4個(gè)二硫鍵穩(wěn)定其構(gòu)象。同源性和聚類分析表明，CcLys2與來(lái)自斯氏珀蝽Plautia stali的C-型溶菌酶的親緣關(guān)系最近。生物信息學(xué)分析結(jié)顯示，CcLys2很可能屬于具有消化作用的C-型溶菌酶。本研究為今后進(jìn)一步闡明CcLys2基因的功能及開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：九香蟲(chóng);溶菌酶;基因克隆;特征分析

　　多細(xì)胞生物常遇到病原生物的侵染，盡管昆蟲(chóng)缺乏經(jīng)典意義上的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，但它們也擁有強(qiáng)大的抗感染手段，如吞噬細(xì)菌和包裹寄生蟲(chóng)的能力，這些反應(yīng)包括激活胞外蛋白酶級(jí)聯(lián)、黑化反應(yīng)及誘導(dǎo)抗菌肽基因表達(dá)[1]。溶菌酶(lysozyme)是先天免疫的重要成員之一，作為一種N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，其在生物作用上因種類差異主要有抗菌防御及消化酶的功能[2]。C-型溶菌酶(1，4-β-N-乙酰胞壁酰胺酶)是一種分泌型溶菌酶，多分布于節(jié)肢動(dòng)物、魚(yú)類、鳥(niǎo)類及哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是至今所有溶菌酶中研究得最為廣泛和深入的一類酶. [3]。肽聚糖和殼聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，而β-1，4-糖苷鍵是穩(wěn)定肽聚糖和殼聚糖的重要結(jié)構(gòu)，C-型溶菌酶通過(guò)特異性裂解β-1，4-糖苷鍵，破壞病原菌細(xì)胞壁而具有溶菌活性，保守的天光氨酸和谷氨酸是發(fā)揮C型溶菌酶溶菌活性所必需的功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn). [4-5]。

　　九香蟲(chóng)Coridius chinensis是一種以葫蘆科植物汁液為食的半翅目兜蝽科昆蟲(chóng)，主要分布于我國(guó)的沿海、中部及西南地區(qū)[6]。九香蟲(chóng)是一種藥食兩用昆蟲(chóng)，臨床上具有理氣止痛、溫中助陽(yáng)等藥用功效。該蟲(chóng)味道及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值俱佳，可作為一種保健食品，貴州道真等地都有食用九香蟲(chóng)的習(xí)慣，是臨床上和保健食品中具有極大開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的資源昆蟲(chóng)[7-8]。九香蟲(chóng)具有較強(qiáng)的免疫防護(hù)能力，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見(jiàn)，提示九香蟲(chóng)有著較為完善的免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲(chóng)血淋巴中的某些蛋白對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞都具有抑制或殺傷作用，吳瑪莉[9]等從九香蟲(chóng)血淋巴中提取的多肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制效果;李尚偉等[10]通過(guò)質(zhì)譜法從九香蟲(chóng)血淋巴分離得到的CcAMP1對(duì)G.+及G.-均具有明顯的抑菌作用;九香蟲(chóng)血淋巴能顯著抑制胃癌細(xì)胞 SGC-7901生長(zhǎng)，通過(guò)進(jìn)一步提純發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)血淋巴的蛋白提取物對(duì)SGC-7901亦具有顯著的生長(zhǎng)抑制活性[11-12]。目前C-型溶菌酶的研究主要集中在脊椎動(dòng)物及蠅類中，而半翅目昆蟲(chóng)C-型溶菌酶的研究相對(duì)較少。該研究從九香蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出一種溶菌酶基因命名為CcLys2，利用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR， RT-PCR)克隆驗(yàn)證了該基因的序列，并用生物信息學(xué)軟件和方法對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該研究為C-型溶菌酶家族再添加一個(gè)新成員，為進(jìn)一步研究CcLys2基因的功能及九香蟲(chóng)資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料來(lái)源

　　九香蟲(chóng)成蟲(chóng)采集于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，以人工種植的南瓜桿莖飼喂于人工氣候箱內(nèi)，飼養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃，濕度(68±5%)，光周期14L：10D。

　　1.2 總RNA提取及第一鏈cDNA制備

　　根據(jù)HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek， GA， USA)說(shuō)明書(shū)提取九香蟲(chóng)總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher， MA， USA)檢測(cè)其純度和濃度，檢測(cè)合格的RNA于-80℃保存?zhèn)溆?。第一鏈cDNA的制備根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher， MA， USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.3 CcLys2基因克隆

　　基于從九香蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的一條溶菌酶基因的部分序列，用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物(CL-F： ATGTTGCTGCTCTTCCTCCT; CL-R： CTGACTGACCACACCAAGATTC)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。在T100 PCR儀(Bio-Rad， CA， USA)上進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL： 25μL2×TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2μL cDNA模板，上/下游引物(10 μM)各1μL，補(bǔ)加21μL滅菌超純水。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸40s， 30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定，送陽(yáng)性克隆至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所測(cè)序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中溶菌酶基因序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

　　1.4 生物信息學(xué)分析

　　CcLys2基因的編碼區(qū)用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用SignalP 5.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，用ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/) 對(duì)酶蛋白進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。用NetOGlyc 4.0Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) 和NetNGlyc 1.0Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)糖基化位，DiANNA 1.1web server(http：//clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)預(yù)測(cè)二硫鍵，KinasePhos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，PSORT II Prediction(https：//psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。用InterPro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro)分析酶蛋白的結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN 9(Lynnon Biosoft， CA， USA)將CcLys2氨基酸序列與其他13種昆蟲(chóng)溶菌酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA X構(gòu)建溶菌酶的鄰接樹(shù)(NJ法)，重復(fù)運(yùn)行1000次，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示自舉檢驗(yàn)值。表2為氨基酸序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的溶菌酶來(lái)源物種及相應(yīng)的GenBank登錄號(hào)。用PredictProtein(https：//www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)成熟CcLys2的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用 SWISS-MODEL (https：//swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL2.3(Schrodinger， New York， USA)繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 CcLys2的cDNA克隆

　　九香蟲(chóng)總RNA電泳圖顯示清晰的28S和18S兩條帶(圖1-A)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示其A260/A280比值為1.90，故提取的總RNA濃度及純度較好，能滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。RT-PCR擴(kuò)增九香蟲(chóng)溶菌酶CcLys2基因的cDNA序列，得到單一明亮且符合預(yù)期大小的條帶，測(cè)序驗(yàn)證其長(zhǎng)度為1096bp(圖1-B)。CcLys2基因的cDNA長(zhǎng)度為1096bp(GenBank登錄號(hào)：MN816376)，包含一個(gè)長(zhǎng)672bp的開(kāi)放閱讀框，編碼223個(gè)氨基酸(aa)，3′端非編碼區(qū)為424bp，具有典型的加尾信號(hào)AATAAA(圖2)。

　　2.1 CcLys2特征分析

　　九香蟲(chóng)溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa組成的信號(hào)肽，成熟蛋白由210 aa組成。理

　　A：九香蟲(chóng)總RNA;B： CcLys2基因擴(kuò)增。

　　M： DL2000 DNA marker; 1：CcLys2基因;圖1 九香蟲(chóng)溶菌酶CcLys2擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electropherogram of the CcLys2 gene amplification

　　化性質(zhì)分析表明，成熟CcLys2的分子式為C1013H1566N282O331S11，分子量為23.34 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.20;含有30個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp和Glu)，25個(gè)正電荷氨基酸殘基(Arg和Lys)。親水性平均系數(shù)為-0.56，不穩(wěn)定指數(shù)為24.32，這表明成熟CcLys2為穩(wěn)定的親水蛋白。成熟CcLys2具有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N36， N135)和17個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，6個(gè)磷酸化位點(diǎn)(S82， S132， S134， S151， S198， Y120)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，CcLys2為分泌蛋白，分布在細(xì)胞外基質(zhì)的概率為77.8%，而分布在細(xì)胞質(zhì)及線粒。

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