摘 要：利用鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，并分別運用考馬斯亮藍(lán)R250和FITC-鬼筆環(huán)肽來染色顯示細(xì)胞微絲，探索和改進實驗方法，以便有效觀察細(xì)胞微絲的分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，采用鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞作為實驗材料，傳代成纖維狀細(xì)胞鋪展良好，經(jīng)固定、通透并染色后，可在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下顯示微絲束在細(xì)胞中的分布，既便于實驗觀察，也有助于學(xué)生對微絲骨架作用的理解和掌握。

　　關(guān)鍵詞：微絲;細(xì)胞骨架;熒光顯微鏡

　　在細(xì)胞內(nèi)，微絲是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合形成的纖維絲，而肌動蛋白又以肌動蛋白單體(或稱球狀肌動蛋白，G-actin)或由單體組裝而成的纖維狀肌動蛋白(F-actin)多聚體2種形式存在。F-actin是由多個G-actin構(gòu)成的長鏈纖維，2條F-actin反相平行結(jié)合成螺旋鏈，發(fā)揮生理功能。由微絲形成的微絲束又稱為應(yīng)力纖維，常橫貫于細(xì)胞長軸。微絲對細(xì)胞貼附、鋪展、運動、內(nèi)吞、細(xì)胞分裂等許多細(xì)胞功能起著重要作用，而微絲又與微管、中間絲組成真核細(xì)胞中的三維纖維網(wǎng)絡(luò)骨架體系，這些由蛋白質(zhì)聚合而成的細(xì)胞骨架主要功能包括：調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)容物的空間分布，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞運動及形態(tài)。研究表明，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，細(xì)胞骨架的改變也與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]，如囊性纖維化肺這一慢性疾病除了受到相關(guān)基因調(diào)控外，還提示與誘導(dǎo)增加肌動蛋白的聚合，從而促進微絲束的形成相關(guān)[2]。

　　“動物細(xì)胞微絲的觀察”是生物科學(xué)本科層次開設(shè)的實驗必修項目之一，現(xiàn)有的教學(xué)實驗參考指導(dǎo)書[3-5]，大多所列實驗步驟較復(fù)雜，實驗所用細(xì)胞及試劑材料無法購買，或在本科實驗教學(xué)中顯示效果不明顯。近年來，筆者在細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)中，利用鼠胚組織進行原代培養(yǎng)并成功傳代培養(yǎng)形成的成纖維狀細(xì)胞作為實驗材料，開展了動物細(xì)胞骨架的標(biāo)記及觀察實驗。實驗分別采用非特異性蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)，以及特異性熒光染料FITC-鬼筆環(huán)肽來標(biāo)記染色，通過光學(xué)顯微鏡與熒光顯微鏡來觀察微絲在細(xì)胞中的分布及形態(tài)特征。與考馬斯亮藍(lán)R250這一普通蛋白質(zhì)染料不同，鬼筆環(huán)肽是從毒性菇類中分離的生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反，不與肌動蛋白單體分子結(jié)合，只與多聚體的F-actin結(jié)合，而用FITC或Rhodamin等熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。

　　1 實驗材料

　　實驗細(xì)胞：小鼠鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞(來源于本科學(xué)生培養(yǎng)的鼠胚組織原代培養(yǎng)細(xì)胞)。

　　實驗試劑及器材：1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、0.1%TritonX-100、0.25%考馬斯亮藍(lán)R250、5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽、5μg/mL Hochest33258、24孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板用圓形細(xì)胞爬片(即圓形蓋片，直徑14mm)、parafilm封口膜。

　　2 實驗方法

　　2.1 細(xì)胞爬片的制備 將生長良好的鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞消化后，稀釋細(xì)胞至104～105個/mL濃度。準(zhǔn)備24孔培養(yǎng)板，每孔預(yù)先放入適量血清培養(yǎng)基，并放入無菌圓形爬片，細(xì)胞添加至圓形爬片上方。如不用24孔培養(yǎng)板，爬片也可放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進行細(xì)胞培養(yǎng)。37℃，5%CO2條件下繼續(xù)進行細(xì)胞培養(yǎng)。

　　2.2 細(xì)胞的固定及通透 24h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，標(biāo)記生長良好的培養(yǎng)孔，吸去培養(yǎng)基，用37℃預(yù)溫PBS輕輕清洗細(xì)胞3次，快速洗去殘留的培養(yǎng)基及血清。加入4%的多聚甲醛固定20min，吸去固定液，再用PBS清洗細(xì)胞3次。加入0.1%TritonX-100處理20～30min，繼續(xù)用PBS清洗細(xì)胞3次。小心取出在24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)有鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞的蓋片，略晾干后，進行后續(xù)的染色實驗。

　　2.3 制片及染色方法 首先，在2片封口膜上分別滴加0.25%考馬斯亮藍(lán)R2505μL和5μg/mL的FITC-鬼筆環(huán)肽5μL。取出處理過的細(xì)胞爬片倒扣在膜上室溫避光染色40min(即細(xì)胞面朝下反扣在預(yù)加染色液的膜上)，夏季時間可以短一些。染色完成后用PBS輕緩沖洗清洗細(xì)胞3次，洗去多余的染液。考馬斯亮藍(lán)染色的細(xì)胞爬片，可待爬片稍晾干后，直接放于載玻片上用普通光學(xué)顯微鏡在白光下觀察。而用FITC-鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞爬片，繼續(xù)倒扣在5μg/mLHochest33258染液中染色細(xì)胞5～10min，用PBS清洗細(xì)胞3次后，細(xì)胞爬片也同樣放在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察。

　　2.4 普通光學(xué)顯微及熒光顯微鏡的觀察 染色細(xì)胞爬片均運用Olympus BX41顯微鏡觀察，40倍物鏡下已能清晰觀察到鋪展良好的成纖維狀鼠胚傳代培養(yǎng)細(xì)胞，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用Image Pro Plus 5.0(IPP)軟件對所有顯微照片進行標(biāo)尺標(biāo)記，雙熒光圖片則使用IPP軟件進行熒光照片的拼合。

　　3 結(jié)果與分析

　　3.1 考馬斯亮藍(lán)R250染色效果 運用普通光學(xué)顯微鏡在白光下觀察，鼠胚傳代成纖維狀細(xì)胞的生長分裂旺盛，細(xì)胞鋪展好，形態(tài)舒展并有較多的細(xì)胞附著在蓋玻片上，可清晰觀察到考馬斯亮藍(lán)染色的鼠胚細(xì)胞胞體突出豐富，立體感強，不僅可見染成淺藍(lán)色縱貫細(xì)胞軸的微絲，還可見染成深藍(lán)色的細(xì)胞核。

　　3.2 雙熒光染料染色效果 用FITC-鬼筆環(huán)肽與Hochest33258雙熒光染色的細(xì)胞，用紫外光激發(fā)，則細(xì)胞核產(chǎn)生明亮的藍(lán)色熒光，而用藍(lán)光激發(fā)，微絲則產(chǎn)生清晰的綠色熒光。用IPP軟件拼合標(biāo)記細(xì)胞核及微絲。

　　4 結(jié)論

　　在“動物細(xì)胞微絲的觀察”教學(xué)實驗中，我們運用考馬斯亮藍(lán)R250和FITC-鬼筆環(huán)肽對微絲進行對照標(biāo)記顯示?？捡R斯亮藍(lán)并不能夠特異性地顯示細(xì)胞微絲的分布，是利用Triton X-100處理細(xì)胞后可以脫除不穩(wěn)定的非骨架蛋白，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的微絲蛋白仍能保留下來染色顯示。而用FITC熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布，在本實驗中顯示效果好，熒光清晰，染色對比明顯，有助于學(xué)生對細(xì)胞微絲理解和掌握。

　　細(xì)胞生物學(xué)實驗是一門單獨設(shè)課的實驗課程，實驗課只在每周固定時間段開設(shè)，學(xué)生無法連續(xù)進行實驗。近年來，通過多次試驗、反復(fù)摸索和研究，形成了從鼠胚原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞活性觀察、細(xì)胞骨架染色顯示及運用CCK8法檢測細(xì)胞增殖這一系列可每周單獨設(shè)課的連續(xù)實驗內(nèi)容。其中“動物細(xì)胞微絲的觀察”這一實驗項目，根據(jù)實驗設(shè)計，實驗從已制備好的細(xì)胞爬片開始，到最后完成細(xì)胞微絲的顯微觀察大約需要4個學(xué)時。微絲顯示效果好，學(xué)生參與度高，取得了很好的教學(xué)效果。

　　參考文獻

　　[1]陳業(yè)成，趙洪文.細(xì)胞骨架與腫瘤之間的關(guān)系研究進展[J].國際呼吸雜志，2018(12)：933-936.

　　[2]Corvol H，Rousselet N，Thompson K E，et al.FAM13A is a modifier gene of cystic fibrosis lung phenotype regulating rhoa activity，actin cytoskeleton dynamics and epithelial-mesenchymal transition[J].Journal of Cystic Fibrosis，2018，17(2)：190-203.

　　[3]李素文.細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2001.

　　[4]丁明孝，蘇都莫日根，王喜忠，等.細(xì)胞生物學(xué)實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2013.

　　[5]桑建利，譚信.細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

　　推薦閱讀：《黑龍江動物繁殖》Heilongjiang Journal of Animal Reproduction(雙月刊)1993年創(chuàng)刊，是目前國內(nèi)唯一的動物繁殖專業(yè)技術(shù)刊物，公開發(fā)行。