摘要：以馬鈴薯品種隴薯11號(hào)試管薯為受體材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，薯片分化和生根階段的選擇壓分別為Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根階段有效抑菌濃度分別為Cb 500、200 mg/L，農(nóng)桿菌活化時(shí)間為4.5 h、侵染時(shí)間為7 min、共培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)利于遺傳轉(zhuǎn)化。通過該體系將4種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯，獲得了具卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)PCR檢測(cè)，外源基因已導(dǎo)入馬鈴薯基因組中。

　　關(guān)鍵詞：馬鈴薯;試管薯;農(nóng)桿菌介導(dǎo);遺傳轉(zhuǎn)化

　　馬鈴薯是一種產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的宜糧、宜菜、宜飼、宜作工業(yè)原料的經(jīng)濟(jì)作物[1 - 2 ]。馬鈴薯在生長(zhǎng)期間易受多種病毒的危害，病毒侵染造成馬鈴薯種質(zhì)退化，產(chǎn)量嚴(yán)重降低。迄今為止，幾乎沒有有效的化學(xué)藥劑來防治病毒病，目前解決馬鈴薯退化的有效途徑是組培脫毒，但該法成本高且工作量大，不能解決病毒的再侵染問題，能維護(hù)無毒或低毒的有效期不長(zhǎng)，2～3 a后產(chǎn)量又會(huì)嚴(yán)重下降。馬鈴薯是同源四倍體作物，若采用常規(guī)方法選育抗病毒品種，則存在天然抗性基因資源缺乏，且育種周期長(zhǎng)、抗性基因的遺傳不穩(wěn)定以及遠(yuǎn)緣雜交種間障礙等問題。馬鈴薯抗病毒基因工程的發(fā)展解決了這一難題，通過基因工程改良馬鈴薯品種具有基因明確、產(chǎn)物已知、目標(biāo)具體、準(zhǔn)確快速、可預(yù)見性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，且馬鈴薯是無性繁殖植物，轉(zhuǎn)基因植株無性后代不發(fā)生分離，給轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)、鑒定帶來諸多方便。

　　建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于獲得轉(zhuǎn)基因植株至關(guān)重要。在馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化中以葉片、莖段、薯片作為受體已廣泛應(yīng)用，其中試管薯片作為受體材料傷口面積大，且薯塊本身含有較高含量的酚類物質(zhì)，有助于農(nóng)桿菌的侵染和轉(zhuǎn)化[3 - 5 ]，不經(jīng)愈傷化可直接誘導(dǎo)芽再生。薯片轉(zhuǎn)化過程中不需要預(yù)培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單方便，周期短，但針對(duì)不同基因型轉(zhuǎn)化的適宜條件有一定差異。我們以馬鈴薯品種隴薯11號(hào)脫毒試管苗為材料，采用農(nóng)桿菌菌株LBA4404為介導(dǎo)，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒外殼蛋白融合基因?qū)腭R鈴薯，并通過對(duì)選擇壓、抗菌素濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行選擇，建立了一套優(yōu)化的高效轉(zhuǎn)化體系。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　供試材料為馬鈴薯品種隴薯11號(hào)脫毒苗，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。供試菌株LBA4404含有質(zhì)粒pART27-XSYV-rh(甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)[6 ]，pART27- XSYV-rh含4 種病毒(PVX、PVS、PVY 和 PLRV)CP基因片段，抗性標(biāo)記為卡拉霉素(Kan)。DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分、植物激素、抗生素、添加劑均購自美國(guó)Sigma 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

　　1.2 培養(yǎng)基

　　YEP液體培養(yǎng)基為10 g/L酵母提取物+ 10 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏。試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)5 mg/L。試管薯片分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+吲哚乙酸(IAA)1.0 mg/L+赤霉素(GA3)0.2 mg/L+6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.5 mg/L+玉米素核苷(ZT)2.0 mg/L。生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。

　　1.3 轉(zhuǎn)化外植體的獲得

　　將隴薯11號(hào)試管苗在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d，長(zhǎng)成壯苗后用于誘導(dǎo)試管薯。參照“固體+液體”的方法誘導(dǎo)試管苗結(jié)薯[7 ]。

　　1.4 遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

　　1.4.1 誘導(dǎo)芽與生根選擇壓確定 無菌條件下取直徑約為0.5 cm的隴薯11號(hào)試管薯，切成厚度為2 mm左右的薄片，分別接種于附加0、25、50、75、100 mg/L 卡拉霉素(Kanamycin，Kan)的試管薯片分化培養(yǎng)基中，每處理接種20塊，3次重復(fù)，間隔14 d繼代1次，接種28 d后觀察薯片生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)出芽率，確定抑制芽分化的最低Kan濃度。將隴薯11號(hào)試管苗剪成帶2個(gè)腋芽的莖段，分別接到含Kan濃度0、25、50、75、100 mg/L的生根培養(yǎng)基中，3個(gè)重復(fù)，21 d后觀察并記錄生根狀況，確定抑制生根最適Kan濃度。

　　1.4.2 農(nóng)桿菌工程菌生長(zhǎng)曲線 挑取農(nóng)桿菌菌種，接種于含Kan 50 mg/L、鏈霉素(Streptomycin，Str)50 mg/L和利福平(Rifampicin，Rif)20 mg/L的YEP平板上，置28 ℃暗培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落放入5 mL含有同樣抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、260 rpm條件下避光振蕩培養(yǎng)約24～36 h。將活化好的菌液按1∶50放大培養(yǎng)(即取1 mL活化好的菌液加入到50 mL含Kan 50 mg/L、Str 50 mg/L、Rif 20 mg/L的YEP液體培養(yǎng)基中，再置于28 ℃恒溫?fù)u床，260 rpm條件下避光振蕩培養(yǎng))，分別設(shè)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 h共13個(gè)時(shí)間梯度，每個(gè)時(shí)間段各取2 mL菌液，在波長(zhǎng)600 nm下用分光光度計(jì)測(cè)定其紫外吸收值OD600，每處理3次重復(fù)，用未加菌液的YEP液體培養(yǎng)基調(diào)零，計(jì)算3次重復(fù)樣品的OD600平均值，最終確定農(nóng)桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需的搖菌時(shí)間(即OD600=0.5左右的臨界點(diǎn))。

　　1.4.3 侵染時(shí)間 用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液侵染薯片，侵染時(shí)間設(shè)為3、5、7、9、11、13、15 min，接種于試管薯片分化培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿20塊，每處理3次重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)薯塊出芽率、污染率及褐化率。

　　出芽率=(出抗性芽薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù))×100%

　　污染率=(污染的薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù))×100%

　　褐化率=(褐化的薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù))×100%

　　1.4.4 共培養(yǎng)時(shí)間 選擇侵染7 min的處理置于28 ℃、黑暗條件下共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為1、2、3、4 d，30 d后觀察薯塊生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)出芽率。

　　1.4.5 抑菌劑濃度 將共培養(yǎng)后的薯塊分別轉(zhuǎn)接到附加羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的試管薯片分化培養(yǎng)基中，光照時(shí)間為14 h/d，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，7 d后觀察農(nóng)桿菌溢出情況。將分化出的芽分別轉(zhuǎn)接到附加Cb 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的生根培養(yǎng)基中，7 d后觀察農(nóng)桿菌溢出情況。

　　1.5 轉(zhuǎn)基因植株鑒定

　　采用CTAB法提取待檢測(cè)植株和對(duì)照植株葉片總DNA，參照賈小霞等[8 ]的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株進(jìn)行PCR鑒定。以非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株為陰性對(duì)照，pART27- XSYV-rh質(zhì)粒為陽性對(duì)照。反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min。取5 uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，分離并觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 Kan濃度對(duì)試管薯片芽分化及生根的影響

　　觀察發(fā)現(xiàn)，試管薯片在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21 d后，不加Kan的薯片直接分化長(zhǎng)出綠色健壯小芽。Kan濃度為25 mg/L時(shí)，薯片增厚、變大、顏色鮮綠，分化出芽情況與不加Kan無明顯差異;Kan濃度為50 mg/L時(shí)，薯片稍有膨大，顏色暗綠，不能分化出芽;Kan濃度為75 mg/L時(shí)，部分薯片膨大，顏色發(fā)暗，褐化嚴(yán)重;Kan濃度為100 mg/L時(shí)，薯片全部褐化死亡。因此確定芽誘導(dǎo)時(shí)Kan濃度為50 mg/L。

　　在抗性芽生根階段仍需要加入Kan，以防止產(chǎn)生大量假陽性植株。接種28 d后，不加Kan的植株生長(zhǎng)旺盛，根系發(fā)達(dá)，而加入Kan的處理雖然也有植株生長(zhǎng)，但是隨著Kan濃度的增加生根受限。Kan濃度為25 mg/L時(shí)，植株生根正常;Kan濃度為50 mg/L時(shí)，能正常生根，但植株生長(zhǎng)緩慢;Kan濃度為75 mg/L時(shí)，部分植株生根，葉片發(fā)黃;Kan濃度為100 mg/L時(shí)，幾乎沒有根系，葉片全部發(fā)黃。因此確定生根時(shí) Kan濃度為75 mg/L。

　　2.2 農(nóng)桿菌工程菌活化時(shí)間確定

　　農(nóng)桿菌液活化時(shí)間對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的效果至關(guān)重要，活化時(shí)間短，菌液濃度過低，不利于侵染，轉(zhuǎn)化率較低，菌液濃度過高，容易使薯片傷口褐化死亡。從含有質(zhì)粒pART27-XSYV-rh的農(nóng)桿菌LBA4404- pART27- XSYV- rh的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果(表1)?？梢钥闯觯罨囵B(yǎng)時(shí)間為4.5 h左右時(shí)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)最快。

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