摘 要：四氫嘧啶是天冬氨酸的環(huán)狀氨基酸衍生物，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、藥品等領(lǐng)域。通過比較了5個不同來源的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，發(fā)現(xiàn)從專性嗜堿芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus OF4)來源的基因簇整合到大腸桿菌BW25113中后，得到的重組菌pYB1s-BPectABC/BW25113產(chǎn)四氫嘧啶能力最好。利用單因素試驗初步優(yōu)化了pYB1s-BPectABC/BW25113全細(xì)胞催化條件： 以100 mmol·L-1天冬氨酸鈉和100 mmol·L-1甘油為底物，在100 mmol·L-1 KCl的轉(zhuǎn)化液(pH=7.0)中，30℃下反應(yīng)24 h，最終四氫嘧啶的產(chǎn)量可達(dá)3.10 g·L-1，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到0.129 g·L-1·h-1。本研究初步得到了四氫嘧啶合成重組菌pYB1s-BPectABC/BW25113，為后續(xù)四氫嘧啶的研究奠定了基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：四氫嘧啶;全細(xì)胞催化;天冬氨酸鈉;大腸桿菌;重組

　　四氫嘧啶，化學(xué)名為1，4，5，6四氫2甲基4嘧啶羧酸，是天冬氨酸的環(huán)狀氨基酸衍生物[1]。四氫嘧啶廣泛存在于嗜鹽或耐鹽的細(xì)菌域或古菌域中，是一種對極端溫度、高滲透壓和干燥等極端環(huán)境具有保護性作用的電解質(zhì)物質(zhì)[2]。四氫嘧啶因其獨特的保護特性被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品及藥品等領(lǐng)域，包括防止皮膚老化和細(xì)胞損傷的化妝品添加劑[3]，保護蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑[4]、PCR反應(yīng)的增強劑[5]、微生物的干燥保護劑[6]，以及治療阿爾茲海默癥[7]、過敏性鼻炎[8]、特應(yīng)性皮炎[9]、結(jié)腸炎[10]和肺部炎癥

　　[11]等疾病的藥物成分。目前四氫嘧啶的交易價格在1000美元·kg-1，是市場上的高價商品[12]。因此，四氫嘧啶成為當(dāng)下的研究熱點之一。四氫嘧啶的生物合成途徑最初是在1990年，由Peters等[13]在延長鹽單胞菌Halomonas elongata中通過同位素標(biāo)記以及核磁共振(NMR)方法發(fā)現(xiàn)的。它是從合成天冬氨酸家族氨基酸的中心代謝樞紐物質(zhì)L天冬氨酸β半醛(LASA)開始，由四氫嘧啶3個獨特的酶[L2，4二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(EctB;EC 2.6.1.76)，L2，4二氨基丁酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EctA;EC 2.3.1.178)和四氫嘧啶合成酶(EctC;EC 4.2.1.108)]介導(dǎo)，通過轉(zhuǎn)氨、乙?；头肿觾?nèi)縮合三步反應(yīng)合成了四氫嘧啶[13-15]。

　　當(dāng)前，四氫嘧啶的生產(chǎn)方法以微生物發(fā)酵法為主，微生物發(fā)酵法又分為直接發(fā)酵法和全細(xì)胞催化法[16-17]。直接發(fā)酵法生產(chǎn)四氫嘧啶常用的工程菌有嗜鹽或耐鹽細(xì)菌以及異源細(xì)菌大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌[18-20]，而全細(xì)胞催化法主要使用大腸桿菌[21-22]。與直接發(fā)酵法相比，全細(xì)胞催化法可以避免嗜鹽或耐鹽細(xì)菌帶來的高鹽誘導(dǎo)問題，不存在對發(fā)酵罐及相關(guān)設(shè)備的腐蝕，具有反應(yīng)條件溫和的優(yōu)勢;全細(xì)胞催化使用大腸桿菌，相比于其他細(xì)菌更易于培養(yǎng)和實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[19];此外，全細(xì)胞催化法生產(chǎn)四氫嘧啶還具有雜質(zhì)含量少、產(chǎn)物易于分離純化、菌體可以重復(fù)利用等優(yōu)點，因此全細(xì)胞催化法合成四氫嘧啶近年來備受推崇[22]。本研究擬以價格低廉，易于獲得的天冬氨酸鈉和甘油為底物，合成高價值的四氫嘧啶。通過以大腸桿菌BW25113為底盤細(xì)胞，構(gòu)建了合成四氫嘧啶的工程菌株，并對該工程菌株的全細(xì)胞催化條件進行了優(yōu)化，獲得高產(chǎn)四氫嘧啶的菌株及優(yōu)化條件，為四氫嘧啶的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Gibson酶購自NEB(北京)有限公司;胰蛋白胨和酵母提取粉購自英國Oxoid公司;L天冬氨酸、L阿拉伯糖和氫氧化鈉購自中國國藥集團有限公司;鏈霉素購自生工(上海)生物工程有限公司;冰醋酸和乙酸鈉西隴化工股份有限公司;其余均是分析純試劑。

　　1.1.2 質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)基 質(zhì)粒pYB1s、菌株大腸桿菌BW25113均來自本實驗保藏。LB培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g。ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 L)：955 mL ZY培養(yǎng)基，20 mL 50×5052，20 mL 50×M，10 mL 20%阿拉伯糖，200 μL 1000×微量元素，200 μL 1 mol·L-1硫酸鎂，1 mL鏈霉素。ZY培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g。50×5052(1 L)：25%甘油，2.50%葡萄糖。50×M(1 L)：1.25 mol·L-1磷酸二氫鈉，1.25 mol·L-1磷酸二氫鉀，2.5 mol·L-1氯化銨，0.25 mol·L-1硫酸鈉。1000×微量元素：50 mmol·L-1氯化高鐵，20 mmol·L-1氯化鈣，10 mmol·L-1氯化錳，10 mmol·L-1硫酸鋅，2 mmol·L-1氯化鈷，2 mmol·L-1氯化銅，2 mmol·L-1氯化鎳，2 mmol·L-1鉬酸鈉，2 mmol·L-1硼酸。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　貝克曼J26冷凍離心機購自美國貝克曼有限公司;waters高效液相購自沃特世科技(上海)有限公司;UV1800分光光度計購自日本島津公司;自動凝膠成像系統(tǒng)JS68D購自上海培清科技有限公司;蛋白電泳儀購自美國Bio-rad公司;恒溫培養(yǎng)箱購自上海智誠分析儀器有限公司。

　　1.3 試驗方法

　　1.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCBI上查找得到專性嗜堿芽孢桿菌Bacillus pseudofirmus OF4、伸長鹽單胞菌Halomonas elongata ATCC 33173、施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri A1501、支氣管敗血波氏桿菌Bordetella bronchiseptica S798、擬態(tài)弧菌Vibrio mimicus SCCF01等5株菌的四氫嘧啶合成基因簇ectABC序列，委托上海生物工程公司進行合成，通過Gibson酶將目的基因與質(zhì)粒pYB1s連接構(gòu)建5個重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞中，獲得pYB1s-BPectABC/BW25113(ectABC基因簇來源于B.pseudofirmus)、pYB1s-HEectABC/BW25113(ectABC基因簇來源于H.elongata)、pYB1s-PSectABC/BW25113(ectABC基因簇來源于P.stutzeri)、pYB1s-BBectABC/BW25113(ectABC基因簇來源于B.bronchiseptica)和pYB1s-VMectABC/BW25113(ectABC基因簇來源于V.mimicus)5株重組菌。

　　1.3.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 挑單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃、220 r·min-1培養(yǎng)8～9 h，再按1%接菌量轉(zhuǎn)接至ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃、220 r·min-1自誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。以菌體(OD600 nm=10)經(jīng)0.9%氯化鈉洗滌2次后破碎離心，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

　　1.3.3 全細(xì)胞催化 自誘導(dǎo)18 h后，通過在8000 r·min-1離心5 min收集菌體，用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，然后再懸浮在含有100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、100 mmol·L-1 KCl和100 mmol·L-1甘油的反應(yīng)轉(zhuǎn)化液中，形成細(xì)胞懸浮液(OD600 nm=10)。使用50 mL三角瓶中裝10 mL細(xì)胞懸浮液在30℃，220 r·min-1，進行催化試驗，分別取0、3、6、9、21、24 h的轉(zhuǎn)化液1 mL，12000 r·min-1離心1 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾完待液相檢測(設(shè)置3組平行試驗)。

　　1.3.4 全細(xì)胞催化體系的優(yōu)化 為了優(yōu)化轉(zhuǎn)化液的組分，在全細(xì)胞催化試驗中比較了不同濃度的天冬氨酸鈉 (50、100、150、200和300 mmol·L-1)對四氫嘧啶生產(chǎn)的影響，獲得最適天冬氨酸鈉濃度之后，在最適的天冬氨酸鈉濃度下，比較了不同濃度的甘油(50、100、150、200和300 mmol·L-1)，以及KCl (0、50、100、200和300 mmol·L-1)對四氫嘧啶生產(chǎn)的影響;為了評估溫度對四氫嘧啶生產(chǎn)的影響，分別在25、30、35、40、45℃下pH 7.0時進行催化試驗;為了評估pH的影響，將反應(yīng)轉(zhuǎn)化液調(diào)節(jié)至pH為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，并在30℃進行催化試驗(設(shè)置3組平行試驗)。

　　1.3.5 四氫嘧啶的檢測方法 四氫嘧啶檢測采用XBridge Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，檢測波長為210 nm，柱溫40℃，流速0.8 mL·min-1，流動相配比為75%乙腈和25%甲酸水(含0.1%甲酸)。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 目的基因的表達(dá)

　　5株重組大腸桿菌經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1。在5株重組大腸桿菌中，EctA的條帶在20 kDa左右，EctB的條帶在44 kDa 左右，EctC的條帶在18 kDa 左右，SDS-PAGE結(jié)果與B.pseudofirmus、H.elongata、P.stutzeri、B.bronchiseptica、V.mimicus預(yù)測的EctA、EctB和EctC分子質(zhì)量大小非常相近。此外，通過比較上清液與沉淀，可知上清液中蛋白條帶非常明顯，而沉淀中蛋白條帶不明顯，說明大部分蛋白都是可溶性蛋白，此外，也可分析出重組pYB1s-BPectABC/BW25113的EctB表達(dá)最好。試驗結(jié)果表明了四氫嘧啶合成基因成功在大腸桿菌BW25113中表達(dá)。

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