摘 要：目的：探究西藏工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內(nèi)內(nèi)生菌。方法：采用培養(yǎng)基培養(yǎng)法和載玻片法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，并利用分子生物學(xué)技術(shù)提取菌株DNA進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：從2種西藏烏頭屬藥用植物中獲得的2株菌株，均屬于半知菌亞門(mén)曲霉屬環(huán)繞亞屬黑色組的真菌。

　　關(guān)鍵詞：西藏;藥用植物;內(nèi)生菌;DNA;烏頭屬

　　內(nèi)生菌(Endophyte)一詞最早是由德國(guó)科學(xué)家de Bary首先提出的，早期定義是指生活在植物組織內(nèi)的微生物。在長(zhǎng)期的研究過(guò)程中，由于不同科研工作者研究的植物、角度、目的及得到的結(jié)論不盡相同，因此“內(nèi)生菌”的概念和解釋被多次修改。截至目前，普遍被認(rèn)可的“內(nèi)生菌”的概念是指生活史中某一時(shí)期生活在植物體內(nèi)而其本身對(duì)植物組織不會(huì)引起明顯病害癥狀的微生物類(lèi)群。一般認(rèn)為，植物內(nèi)生菌與宿主互惠共生、協(xié)同進(jìn)化。

　　近年來(lái)，隨著生態(tài)學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者及相關(guān)的科研工作者對(duì)植物內(nèi)生菌的研究越來(lái)越多。大量研究表明：植物內(nèi)生菌在植物生命過(guò)程中起著十分重要的作用，主要體現(xiàn)在對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、應(yīng)對(duì)生物脅迫等方面具有重要的作用[1]。目前，關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)滲透到醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、植物病理學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。自Vogl于1898年成功從黑麥草(Lolium tu-melentum)的種子中分離得到第1株內(nèi)生真菌以來(lái)[2]，已有很多研究者從不同植物中分離得到了不同種類(lèi)的植物內(nèi)生菌。眾多的研究成果不僅豐富了內(nèi)生菌種類(lèi)，更加深了人們對(duì)內(nèi)生菌的認(rèn)識(shí)。目前，關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究和報(bào)道較多的是從不同植物內(nèi)生菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些具有天然活性的代謝產(chǎn)物，主要包括萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、多肽類(lèi)等[3，4]。可見(jiàn)，植物內(nèi)生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質(zhì)的重要來(lái)源之一。

　　西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物，其中烏頭屬植物在我國(guó)作為藥材的應(yīng)用已有很長(zhǎng)的歷史。據(jù)文獻(xiàn)記載，烏頭屬植物的主要化學(xué)成分是烏頭堿，并含有多糖、香豆素、黃酮、甾體等化學(xué)成分，具有調(diào)節(jié)免疫、麻醉止痛、抗炎和抗腫瘤等多重功效[5]。西藏現(xiàn)有烏頭屬植物73種，占全國(guó)烏頭屬植物總種數(shù)(含變種)的20.50%;該屬資源的豐富度在全國(guó)范圍內(nèi)僅次于四川和云南，其中較明確的藥用種類(lèi)有13種，占西藏烏頭屬植物總種數(shù)的17.81%[6]。西藏烏頭屬植物主要分布在海拔2000～5000m的高山草甸、山坡石隙、礫石草坡和灌木叢林等地[7]。

　　目前，關(guān)于烏頭屬藏藥研究較多的是在其化學(xué)成分及其結(jié)構(gòu)以及生理活性等方面，尚未見(jiàn)對(duì)其內(nèi)生菌的相關(guān)研究報(bào)道。植物內(nèi)生菌按其種類(lèi)一般分為內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌及內(nèi)生放線菌3類(lèi)。為探明西藏烏頭屬植物體內(nèi)內(nèi)生菌的存在及分類(lèi)，本試驗(yàn)對(duì)西藏2種常見(jiàn)的烏頭屬植物工布烏頭和露蕊烏頭莖內(nèi)內(nèi)生菌進(jìn)行了分離與鑒定，以期為今后該屬植物資源的保護(hù)及烏頭屬藏藥的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 工布烏頭和露蕊烏頭屬于毛茛目、毛茛科(Crassulaceae)、烏頭屬(Rhodio-la L.)的植物[8]。工布烏頭和露蕊烏頭植株，均采自西藏林芝市工布江達(dá)縣米拉山東坡，海拔4410m(北緯29°53′6″、東經(jīng)92°20′19″)。

　　1.1.2 培養(yǎng)基及制備方法 采用PDA培養(yǎng)基(葡萄糖10g、土豆200g、瓊脂15g、蒸餾水)，定容到1000mL。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 樣品處理 取工布烏頭和露蕊烏頭的莖用自來(lái)水反復(fù)沖洗后，再用醫(yī)用消毒水沖洗數(shù)遍，放入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)滅菌30min。然后將植物的莖切成3～4cm的小段，再縱向切開(kāi)放入盛有次氯酸鈉溶液的燒杯中15min，之后分別用硫代硫酸鈉、乙醇和無(wú)菌水進(jìn)行沖洗[9]，置于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

　　1.2.2 菌株的形態(tài)觀察 將分離得到的菌株移至新的培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，再將純化后的菌株以點(diǎn)接方式，接種到新的PDA培養(yǎng)基中。待觀察到培養(yǎng)基表面有菌絲生長(zhǎng)時(shí)，用已滅菌的醫(yī)用手術(shù)刀把培養(yǎng)基切成長(zhǎng)和寬為2cm×2cm，之后移到已經(jīng)滅菌的載玻片上，蓋上蓋玻片繼續(xù)培養(yǎng)[10]，設(shè)置智能溫控培養(yǎng)箱的溫度為25℃，濕度為60%～80%的范圍內(nèi)，每2d觀察1次孢子的發(fā)育情況。

　　1.3 純化后菌株的分子生物學(xué)研究

　　1.3.1 菌株DNA的提取 挑取真菌菌絲添加到PBS緩沖液中，加入100U的Lyticase(sigma L4025)，于37℃條件下破壁處理30min。之后用真菌基因組DNA快速提取試劑盒(此試劑盒由寶信生物有限公司提供，貨號(hào)DN1112)提取基因組DNA，用于后續(xù)的基因擴(kuò)增。

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