摘 要：白英含有多種化學(xué)成分，具有潛在的藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景，但抗炎機(jī)制的研究并不完整。本實(shí)驗(yàn)以小鼠RAW264.7細(xì)胞為材料，研究白英甾體化合物的抗炎作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)：白英甾體化合物能明顯抑制產(chǎn)生炎癥的小鼠RAW264.7細(xì)胞的TNF-α的炎癥因子的表達(dá)，提高炎癥細(xì)胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過(guò)保護(hù)線粒體來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。

　　關(guān)鍵詞：白英甾體化合物;TNF-α;線粒體膜電位;抗炎

　　炎癥是機(jī)體自發(fā)產(chǎn)生的一種正常反應(yīng)，但如果反應(yīng)過(guò)度，又會(huì)給機(jī)體帶來(lái)?yè)p傷。如何有效控制炎癥的過(guò)度損傷，減輕炎癥對(duì)身體帶來(lái)的危害，是如今所要研究的重要課題，對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義[1]。白英，又叫鬼目草、葫蘆草等，是茄科茄屬植物，屬多年生蔓性草本植物，分布十分廣泛[2]。白英有很大的藥用價(jià)值，其全草以及根部都可供藥用。目前臨床上對(duì)于白英的應(yīng)用越來(lái)越多，在消腫解毒、抗腫瘤等方面尤為顯著。近年來(lái)，各研究學(xué)者開(kāi)始對(duì)白英的抗炎作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)白英具有較好抗炎效果。研究表明，白英主要通過(guò)其各種化學(xué)成分發(fā)揮作用[3]。TNF-α是非常重要的一種炎癥因子，能夠反映細(xì)胞的炎癥水平，抑制TNF-α的表達(dá)，可以達(dá)到抗炎的目的。線粒體是真核生物非常重要的細(xì)胞器，在機(jī)體中發(fā)揮重要的作用，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生炎癥時(shí)，線粒體會(huì)發(fā)生很明顯的變化，包括上調(diào)ROS水平、降低線粒體膜電位等，可以通過(guò)這些指標(biāo)來(lái)觀察線粒體的情況，因此，研究白英甾體化合物的抗炎作用與對(duì)線粒體的關(guān)系具有重要意義。

　　1 材料

　　1.1 儀器

　　細(xì)胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺(tái);酶標(biāo)儀;倒置顯微鏡;電子天平;低速離心機(jī);熒光顯微鏡等。

　　1.2 試劑

　　DMEM培養(yǎng)基;胎牛血清;PBS;雙抗;CCK-8試劑;TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒;線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)。

　　1.3 藥品與細(xì)胞

　　白英甾體化合物干粉由吉林省中醫(yī)中藥研究院饋贈(zèng)，利用PBS使其溶解，實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞為小鼠RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞庫(kù)，對(duì)照組為地塞米松。

　　2 方法

　　2.1 藥品配制及細(xì)胞培養(yǎng)

　　取白英甾體化合物的干粉，用PBS將其溶解，然后過(guò)濾并進(jìn)行高壓滅菌。小鼠RAW264.7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入胎牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素)，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可供實(shí)驗(yàn)使用。

　　2.2 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活力的影響

　　取培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細(xì)胞，加入培養(yǎng)基并輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮到液體中，加入到96孔板中，使每孔體積200μL，細(xì)胞密度為1×104mL/個(gè)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，然后把孔內(nèi)液體吸出，加入含有不同濃度的白英甾體化合物的DMEM培養(yǎng)基，并加入LPS，分為5組：空白組，白英甾體化合物高、中、低劑量組(白英甾體化合物的濃度分別為40μg·mL-1、20μg·mL-1、5μg·mL-1)，地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組[4]。

　　2.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力

　　上述5組作用24h后，每孔加入10μLCCK-8，靜置30min，把酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)調(diào)至450nm，測(cè)定上述各孔吸收的OD值。

　　2.4 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

　　細(xì)胞培養(yǎng)同上所述，分組情況同上，按照TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)量小鼠RAW264.7的炎癥因子的表達(dá)情況。

　　2.5 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

　　在上述培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入脂多糖，按照分組濃度，加入白英甾體化合物，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每組取1×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以測(cè)定線粒體膜電位的變化情況[5]。

　　2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

　　使用Graphpad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

　　3 結(jié)果

　　3.1 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活力的影響

　　結(jié)果顯示，與空白組相比較，白英甾體化合物的高中低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞活性明顯偏低，白英甾體化合物的高中低劑量組又高于地塞米松組，但各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同濃度的甾體化合物和地塞米松不影響小鼠RAW264.7細(xì)胞活性，對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，與林世和等研究結(jié)果一致[6]。

　　3.2 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

　　結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS顯著提升了小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，模型構(gòu)建成功。與LPS組比較，40μg·mL-1和20μg·mL-1的甾體化合物與地塞米松能夠抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明白英甾體化合物具有較好的抗炎作用。5μg·mL-1的甾體化合物則沒(méi)有顯示出抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)的作用，對(duì)比LPS組，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明白英甾體化合物濃度較低時(shí)，其作用效果不明顯，與劉淑華等研究結(jié)果一致[4]。

　　3.3 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

　　通過(guò)JC-1法測(cè)定線粒體膜電位，用紅、綠2種顏色的熒光分別表示線粒體膜電位的高、低。結(jié)果顯示，空白組呈現(xiàn)紅色熒光，LPS組為綠色熒光，說(shuō)明在LPS的刺激下，細(xì)胞產(chǎn)生炎癥;當(dāng)加入白英甾體化合物后，線粒體膜電位有所提高，并且以劑量依賴(lài)性的方式增強(qiáng)線粒體膜電位，說(shuō)明炎癥反應(yīng)得到抑制。

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