對于皮膚科中芯片的應(yīng)用有哪些呢，正確認(rèn)識有關(guān)芯片應(yīng)用時的一些技巧對皮膚又有什么危害或影響呢， 怎樣來加強(qiáng)對這方面的管理呢?本文選自：《中華皮膚科雜志》,《中華皮膚科雜志》系中華醫(yī)學(xué)會主辦的中華系列雜志之一，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所承辦。高、中、初級皮膚性病科醫(yī)師、科研、預(yù)防、醫(yī)療和教學(xué)人員為主要讀者。

　　摘要：在皮膚科學(xué)研究中,被毛突變小鼠都是用來研究人類同源基因疾病良好的動物模型。國內(nèi)外研究者已獲得了20多個被毛突變系小鼠,如在皮膚、免疫及腫瘤領(lǐng)域得到廣泛運用的裸小鼠;表皮病變引起被毛異常的hr小鼠和ic小鼠;章金濤等的豫醫(yī)無毛小鼠;李善如等發(fā)現(xiàn)的被毛突變無毛小鼠等等。

　　關(guān)鍵詞：皮膚科,醫(yī)學(xué)論文,論文發(fā)表

　　QPCR芯片基本原理及相關(guān)應(yīng)用

　　每張QPCR芯片如同上百個QPCR微反應(yīng)池的集成,每個微反應(yīng)池都固定有基因特異性引物,當(dāng)加入含有模板和熒光基團(tuán)的QPCR反應(yīng)體系后,在相同的反應(yīng)條件下,不同的基因都能同時進(jìn)行特異性擴(kuò)增,每個微反應(yīng)池的位置信息就代表了某個特定基因,利用熒光信號的積累實時監(jiān)測每個微反應(yīng)池中PCR反應(yīng)的過程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就能同時對上百個基因mRNA或cDNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析[3]。與基因芯片相比,QPCR芯片的通量顯著減低,一次至多檢測96個或384個基因,基本相當(dāng)于基因芯片通量的1%,但是QPCR芯片的擴(kuò)增對象經(jīng)過仔細(xì)選擇,是某一組織或病變類型高度相關(guān)的基因,更便于數(shù)據(jù)的分析處理,檢測基因還可以隨研究需要加以改動,便于操作,而且價格比較低廉?；蛐酒蚎PCR芯片的原理不同,但對于基因表達(dá)譜而言,他們的檢測對象(mRNA或cDNA)到實驗結(jié)果(表達(dá)豐度),QPCR與基因表達(dá)芯片都高度一致,許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段,而對于幾十個甚至幾百個基因的表達(dá)豐度檢測,QPCR技術(shù)完全可以取代基因芯片[4]。

　　基因芯片通過對來源于不同個體(正常與患者)、不同組織或不同發(fā)育階段組織細(xì)胞內(nèi)的mRNA(經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA)進(jìn)行檢測,可以對這些基因表達(dá)的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性等進(jìn)行綜合的分析與判斷,迅速將某個或幾個基因與病變聯(lián)系起來,也為進(jìn)一步研究基因間相互作用關(guān)系提供參考。那么中等通量的QPCR技術(shù)是否能夠解決同樣的問題呢?答案是肯定的。計算機(jī)預(yù)測是將基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)與分子信號過程進(jìn)行聯(lián)系的關(guān)鍵步驟。

　　目前廣泛運用的軟件是根據(jù)基因表達(dá)量的變化,計算機(jī)結(jié)合已知信號通路的信息,將“宏觀表型”與分子信號過程結(jié)合。由于這一軟件預(yù)測的基礎(chǔ)是已知信號過程,并不能預(yù)測新的未知信號過程,所以對基因芯片的海量數(shù)據(jù)的利用率有限。而在QPCR芯片的設(shè)計過程中,研究者依據(jù)已知的信號過程選擇檢測對象,盡管選擇的基因總數(shù)不多,但可能都是預(yù)測軟件的參考基因,同樣會得到較好的結(jié)果[5]。在當(dāng)今生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,QPCR作為一種新型實用研究工具得到了越來越高度的重視,其使用量逐年上升,但是QPCR芯片技術(shù)的應(yīng)用才剛剛處于起步階段。有關(guān)學(xué)者開始利用QPCR芯片技術(shù)進(jìn)行多領(lǐng)域醫(yī)學(xué)研究,取得了有突破性意義的成果。SamarS.Azab,SalamaA.Salama等[6]認(rèn)為雌激素天然衍生物2-甲基雌二醇作為(2-me-thoxyestradiol,2ME),在臨床試驗中是乳腺癌一個重要的評價對象。他們在兩種治療組中通過QPCR芯片技術(shù)測試鑒定了Dox細(xì)胞毒性單獨處理和協(xié)同2ME處理后細(xì)胞的基因表達(dá)差異。其研究主要目標(biāo)是評估2-甲基雌二醇在對阿霉素多耐藥性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/Dox)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)影響及其潛在的作用機(jī)理。

　　IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco等認(rèn)為IL-12RB2在人類B細(xì)胞惡性腫瘤中是最為腫瘤抑制基因存在作用的。大鼠IL-12基因敲出后自然產(chǎn)生了B細(xì)胞惡性腫瘤,而且有了肺上皮細(xì)胞腫瘤。但是IL-12沒有能力對表達(dá)IL-12受體的B16黑色素瘤細(xì)胞有直接作用。他們利用QPCR芯片對大鼠IL-12基因正常組和敲出組進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)IL-12能通過抑制血管生成來降低表達(dá)IL-12受體的B16細(xì)胞的致瘤性[7]。AndreasHald,BirgitteRono等[8]認(rèn)為除了在宿主防御方面表現(xiàn)明顯的重要性,巨噬細(xì)胞已經(jīng)被證明在不同的病態(tài)條件,包括慢性炎癥、動脈粥樣硬化和癌癥中扮演一個有害的作用。而巨噬細(xì)胞活化和遷移與細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。這個過程可以通過多個蛋白水解酶完成。在這項研究中,他們利用QPCR芯片進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),同時降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)。此外,基因間的比較的表達(dá)水平相關(guān)的蛋白酶透露他們之間存在較大的差異基因表達(dá)水平,凸顯了巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。除了這些文章還有學(xué)者分別對病原微生物檢測[9][10]、炎癥反應(yīng)研究[11]等方面進(jìn)了相關(guān)研究,得到了很好的研究成果。

　　QPCR芯片在皮膚科學(xué)中的應(yīng)用前景

　　通常認(rèn)為毛發(fā)多少與毛囊數(shù)量及毛囊發(fā)育周期相關(guān),許多研究集中在毛囊本身及毛囊與皮膚微環(huán)境信號分子的相互關(guān)系上,如hid和sa等基因直接作用于毛球,引起毛發(fā)發(fā)育障礙[16],而經(jīng)過皮膚病理學(xué)家JohnSundberg博士的鑒定,snthr-1Bao稀毛小鼠皮膚的主要病變是過度角化,導(dǎo)致毛發(fā)生長困難,毛囊的數(shù)目并未顯著減少、主要形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。因此,snthr-1Bao小鼠和hr等小鼠一樣,是表皮角化、毛發(fā)阻生、皮膚慢性損傷并發(fā)無菌性炎癥的理想模型。僅從組織病理學(xué)來看,snthr-1Bao稀毛突變小鼠皮膚的原發(fā)病變與人類Alagile綜合癥比較相似。

　　Alagile綜合癥為常染色體隱性遺傳性疾病,臨床表現(xiàn)為頭皮斑禿和全身廣泛毛發(fā)稀少,性腺功能減退,身材發(fā)育延遲等;病組織理表現(xiàn)為表皮輕度棘皮病樣改變,角化過度而深入毛孔形成角栓,但目前該病分子機(jī)制尚未完全清楚[17],需要開發(fā)出相應(yīng)的模型進(jìn)行分子水平上的研究。“皮膚表達(dá)關(guān)鍵基因QPCR芯片”可以為這方面的研究提供了一種新的嘗試。從QPCR芯片開發(fā)的角度,snthr-1Bao稀毛小鼠也是待開發(fā)的“皮膚表達(dá)關(guān)鍵基因QPCR芯片”很好的試驗對象,可以為芯片的設(shè)計、優(yōu)化及將來的推廣應(yīng)用提供了最直接的檢驗。再例如在皮膚科學(xué)中,瘢痕疙瘩是在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細(xì)胞過度增殖和膠原過度分泌所致的病理性瘢痕,目前尚無確切有效的藥物。眾多學(xué)者通過大量基礎(chǔ)實驗研究和臨床證據(jù)表明,瘢痕疙瘩的發(fā)生機(jī)理與多個基因的功能活動密切相關(guān)。

　　SmithJC,BooneBE,OpalenikSR[18]等通過使用QPCR研究發(fā)現(xiàn)降低Wnt信號表達(dá)的多種抑制因素對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表面這個基因的作用。同時發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中的誘餌受體IL-13Rα2是低表達(dá),在瘢痕疙瘩中幾乎不存在。得到QRT-PCR證實的有用結(jié)論是,支持在瘢痕疙瘩治療中提高IL-13的活性。Chang等.(2002)[19]通過研究發(fā)現(xiàn)HOX基因在發(fā)育的胚胎階段有重要作用,能夠調(diào)節(jié)人的分化細(xì)胞,包括人類的真皮纖維母細(xì)胞,不同的HOX基因表達(dá)可能成為組成瘢痕疙瘩的惡性表型。魏斌,范金財?shù)萚20]運用RNAi干擾正常皮膚成纖維細(xì)胞前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)基因的表達(dá),利用realtimeRT-PCR驗證siRNA沉默效果;應(yīng)用全基因組芯片檢測基因表達(dá)譜變化。

　　檢測到與PTGS2基因相關(guān)的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同發(fā)揮作用的相關(guān)基因,證明PTGS2與瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系,為治療瘢痕疙瘩提供了一個潛在的候選靶點。BockO,YuH,ZitronS[21]研究了beta1-3和它們的受體IandII對皮膚纖維原細(xì)胞的影響。其他的一些基因,包括IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色體臂2q或者7p,都認(rèn)為與瘢痕疙瘩形成有一定的關(guān)聯(lián)(Marner-os,2004)[22]。因此研發(fā)相關(guān)的QPCR芯片,運用這種先進(jìn)的技術(shù)手段,來探討這些基因?qū)τ趯τ隈：鄹泶癜l(fā)生的作用機(jī)制;觀察敲減或者改變這些基因的表達(dá),是否導(dǎo)致正常皮膚成纖維細(xì)胞全基因表達(dá)譜向瘢痕疙瘩方向改變,以期在基因水平上探索無瘢痕創(chuàng)傷愈合的新途徑。