摘要：不同原核生物的16srRNA古老且同源，既含有保守序列又有可變序列，保守性反映生物物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育提供線索;可變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)，其序列變化與進(jìn)化距離相對應(yīng)，在細(xì)菌種屬分類鑒定中廣泛應(yīng)用。Edman等利用16srRNA技術(shù)將孢子病菌與其他38種真菌分子進(jìn)化樹進(jìn)行比較，證實其為獨立的一屬。我國學(xué)者曾用16srRNA作探針，對來自貴州省不同地區(qū)、不同時間的209株傷寒菌進(jìn)行核糖體分型(RT型)。結(jié)果顯示，這些菌株分屬于26個RT型，以RTl和RT2型為優(yōu)勢，提示貴州地區(qū)傷寒存在眾多的克隆群，這可能是貴州省傷寒多年來發(fā)病率一直居高的原因。核糖體分型技術(shù)雖然特異性較強，敏感性也較高，不需要特定的儀器，但操作較繁雜，需要較熟練的技術(shù)。

　　關(guān)鍵詞：檢驗醫(yī)學(xué),臨床醫(yī)學(xué),醫(yī)學(xué)儀器

　　法大多都需要特殊的儀器設(shè)備和具有操作水平熟練的專業(yè)技術(shù)人員，實驗成本也較高，所以只在少數(shù)大醫(yī)院使用，這些醫(yī)院的實驗設(shè)備好，人員素質(zhì)高的中心實驗室使用。這些技術(shù)對于細(xì)菌的許多遺傳學(xué)和分類學(xué)等方面的問題能給予更確定的答案，并通過檢測種屬特異性基因來檢測標(biāo)本中病原體的存在與否，能自動快速地對樣本進(jìn)行檢測鑒定。對于臨床病原細(xì)菌的鑒定首先要涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可以根據(jù)染色反應(yīng)及形態(tài)特征，初步確定細(xì)菌的大致類型，對選擇鑒定方法和合適的培養(yǎng)基具有指導(dǎo)意義。如正常無菌部位的標(biāo)本通過染色鏡檢，只要檢出細(xì)菌，即可診斷為感染類型，盡快為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。傳統(tǒng)病原菌的分離鑒定較費時耗力，檢測靈敏度差，雖然如此仍是臨床醫(yī)學(xué)細(xì)菌鑒定的主要途徑，也是分子生物鑒定的基礎(chǔ)條件。分子生物學(xué)技術(shù)不能顯示微細(xì)菌的形態(tài)特征和生化特征等生存性以及是否存在感染的過程，反之，細(xì)菌的分離培養(yǎng)可以證實其生存性及細(xì)菌的形態(tài)特征和代謝產(chǎn)物等，同時病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)是深入進(jìn)行臨床研究、藥敏實驗和流行病學(xué)的基礎(chǔ)。

　　檢查細(xì)菌對培養(yǎng)基中所含糖(醇、苷)降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，可用以鑒定細(xì)菌種類。細(xì)菌可產(chǎn)生各種各樣的酶，這些酶可以特異性地分解相關(guān)底物，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)出某種顏色或在紫外線下發(fā)出熒光，因而，我們只需在培養(yǎng)基內(nèi)加入人工合成底物，根據(jù)菌落的顏色和熒光的情況即可知道是何種細(xì)菌。一般情況，人工合成底物由顯色基團(tuán)和細(xì)菌可代謝物質(zhì)如糖苷類、氨基酸或肽類兩部分組成，通常情況下底物為無色。在特異性酶作用下游離出產(chǎn)色基團(tuán)并產(chǎn)生熒光或顯示一定顏色，用紫外燈觀察菌落產(chǎn)生的熒光或直接觀察菌落顏色即可對菌種做出鑒定。

　　細(xì)菌的內(nèi)部和表面含有大量的抗原決定簇，因此可以利用抗體抗原的結(jié)合原理利用抗體標(biāo)記細(xì)菌，然后用標(biāo)記酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)與抗體結(jié)合，酶催化的呈色反應(yīng)可以間接反映細(xì)菌的種類和數(shù)量。目前，很多重要的病原物均有相應(yīng)的抗體，如抗HCV、抗HAV、梅毒抗體、抗HIV、優(yōu)生優(yōu)育TORCH系列等。該法具體程序為采用預(yù)先包被了的細(xì)菌單克隆抗體的微量塑料板，加入增菌液處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用完畢后用酶標(biāo)儀測定OD值來判定結(jié)果。因此，要得出可靠的結(jié)果，供試樣品首先必須進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，以便提高檢出陽性率。此法除保留抗體、抗原反應(yīng)的高度特異性外，由于標(biāo)記酶的酶促反應(yīng)的放大作用，使測定的靈敏度更高，檢出細(xì)菌極限范圍在105-106cfu/ml。

　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)英文簡稱PCR，是近年應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，尤其適用于培養(yǎng)困難或傳統(tǒng)的血清學(xué)方法不易檢測的病原細(xì)菌。該法的原理是：地球上每種生物的遺傳物質(zhì)是不同的，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)就是擴增生物中的特異性基因片段進(jìn)而對生物進(jìn)行鑒定的，例如沙門氏菌就有多個特異性基因，陳洪認(rèn)為，編碼細(xì)胞膜外膜含鐵細(xì)胞受體的基因?qū)ι抽T氏菌診斷有特異性;還有學(xué)者認(rèn)為gyrA基因和rcsC基因之間的插入序列為傷寒沙門菌所特有，對傷寒有診斷意義，可以利用這些特異性的片段制作檢測探針，目前，根據(jù)上述基因設(shè)計引物用于人體或自然界中細(xì)菌的檢測，并形成了試劑盒作為商品銷售。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要的條件有引物、模板和四種脫氧核苷酸，反應(yīng)過程包括高溫變性、低溫退火和延伸三個階段，經(jīng)25-30個循環(huán)，一個DNA分子就可擴增106以上。該技術(shù)由于其具備快速、高度的特異性和敏感性，可不用進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)等特點。

　　擴增片段長度多態(tài)性簡稱AFLP，是目前廣泛應(yīng)用的DNA指紋技術(shù)之一，AFLP通過PCR擴增基因組限制性酶切片段并進(jìn)行電泳分析。具體步驟是先用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結(jié)合位點，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，進(jìn)行電泳呈現(xiàn)不同的譜帶。由于AFLP可以使某一個體出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一個體中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，得到的DNA片段多態(tài)性可作為一種分子標(biāo)記指紋，為研究細(xì)菌屬乃至株間的親緣關(guān)系提供了有效手段。AFLP結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，但該法不但成本較高，而且需要操作者具備較高的檢驗技術(shù)，目前一般醫(yī)院尚難應(yīng)用。