摘要：大豆RLPK2基因(GenBank登錄號：AY687391)是一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因。為分析大豆RLPK2基因的功能，該研究以野生型擬南芥和大豆RLPK2基因過表達擬南芥植株為材料，通過農(nóng)桿菌介導法轉化野生型擬南芥，構建了大豆RLPK2基因過表達載體，分析了葉片衰老過程中葉綠素熒光參數(shù)、抗氧化酶活性及衰老相關基因表達量的變化。結果表明：(1)無論是野生型還是轉基因擬南芥，隨著葉片衰老進程的進行，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(shù)(qP)和光合電子傳遞速率(ETR)均呈下降趨勢，但后者下降趨勢更明顯;(2)激發(fā)壓(1qP)在葉片衰老前期的變化較為平穩(wěn)，后期則急劇增加，且轉基因型比野生型擬南芥增加更明顯;(3)在葉片衰老的各個時期，轉基因擬南芥葉片丙二醛(MDA)含量均顯著高于野生型，而超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均顯著低于野生型;(4)實時熒光定量PCR檢測結果表明，RLPK2轉基因擬南芥中衰老標志基因ATSAG12，衰老關鍵轉錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關鍵酶編碼基因ATACD1表達量顯著上調(diào)。綜上認為，大豆類受體蛋白激酶基因RLPK2參與調(diào)控植物葉片衰老進程，其表達對葉片衰老具有促進作用。

　　關鍵詞：大豆RLPK2基因，葉片衰老，激發(fā)壓，抗氧化酶，丙二醛

　　作為進行光合作用的主要器官，葉片的生長發(fā)育優(yōu)劣直接影響作物的生長、產(chǎn)量及品質(zhì)。葉片衰老是葉片生長發(fā)育進程中的最終階段，它不是葉片細胞的簡單死亡過程，而是一種主動的、受細胞內(nèi)部遺傳程序控制的、器官水平上動態(tài)的細胞程序性死亡過程，并且受到外部多種環(huán)境因素(光照、水分、溫度、礦質(zhì)元素和微生物)及內(nèi)部發(fā)育信號(激素、遺傳和基因調(diào)控)的協(xié)調(diào)控制(初夢圓和于延沖，2019)。此外，葉片衰老還與Ca2+、糖、活性氧(relativeoxygenspecies，ROS)水平和內(nèi)源激素的變化等因素密切相關(張藝函等，2019)。葉片衰老主要表現(xiàn)為光合同化能力下降，細胞結構的退化，光合色素包括葉綠素和類胡蘿卜素的降解，蛋白質(zhì)和核酸降解，ROS與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，水解酶及生長抑制因子持續(xù)增長等，這些特征在多種植物中已有描述(Wooetal.，2013;Wangetal.，2016)。葉片衰老能夠增強植物對生存環(huán)境的適應性，從而有利于其生存和延續(xù)。但對農(nóng)作物的生長而言，植物過早衰老引起的葉片同化功能的減退也極大地影響和限制了農(nóng)作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，導致作物品質(zhì)及產(chǎn)量的損失。因此，對葉片衰老機理的研究不僅在揭示植物的生態(tài)適應等方面具有一定意義，還在糧食生產(chǎn)上抑制早衰具有重要意義。大豆在我國播種面積僅次于玉米、水稻、小麥和馬鈴薯，是第五大糧食作物，其含有豐富的植物蛋白質(zhì)，同時又可用來榨油，因此是我國重要的油料作物。相關研究表明，葉片早衰嚴重影響著大豆正常的生長發(fā)育，并會引起產(chǎn)量及品質(zhì)的下降(呂林濤，2018)。鑒定大豆葉片衰老相關基因及其功能對于提高大豆的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和育種改良具有重要的科學意義和深遠的應用價值。

　　植物類受體蛋白激酶(receptorlikeproteinkinase，RLKs)具有特殊的蛋白質(zhì)結構，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶總量的60%，是植物中較大的基因家族之一，參與細胞信號轉導途徑過程，并在植物的生長發(fā)育和環(huán)境的適應過程中具有重要作用(Shiu&Bleecker，2001)。其中，富含亮氨酸重復序列(leucinerichrepeat，LRRs)型類受體蛋白激酶是RLKs中最大的一個亞家族(Coletteetal.，2011)。迄今為止，LRRsRLKs蛋白的結構特點和表達模式在擬南芥(阿依江·哈拜克等，2014)、煙草(曾建斌，2011)、花生(莊瑞蓉等，2018)、馬鈴薯(謝潔等，2019)等植物中均有研究。相關研究表明，LRRRLKs在植物整個生長發(fā)育過程中具有重要作用(Diévart&Clark，2004)。謝潔等(2019)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯LRR類受體蛋白激酶SCLRRK1在低溫條件下表達受到抑制，證實其參與低溫脅迫響應過程。Zhou等(2016)發(fā)現(xiàn)LRRRLKs型基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥的發(fā)育過程。作為LRRRLKs家族中被研究較為廣泛的一員，BAK1在油菜素內(nèi)酯(BR)信號轉導途徑(Heetal.，2007)、植物先天免疫反應(韋莉等，2019)、細胞死亡調(diào)控(Zhouetal.，2019)等方面發(fā)揮作用。大豆RLPK2基因(GenBank登錄號：AY687391)是植物分子遺傳學研究組李小平副教授前期以大豆科豐34為材料篩選到的一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因，前期研究結果發(fā)現(xiàn)人工誘導衰老處理顯著提高了該基因在大豆初生葉片中的轉錄水平，初步分析顯示該基因可能參與大豆葉片衰老的調(diào)控過程。本研究在此基礎上構建了大豆RLPK2基因過表達載體并轉化野生型擬南芥，對轉基因擬南芥葉片衰老進程進行分析，進一步揭示該基因在植物葉片衰老中的功能，以期為延緩葉片衰老從而提高大豆作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料及培養(yǎng)方法

　　本試驗所使用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型(WT)擬南芥(Columbia0)。培養(yǎng)環(huán)境條件如下：溫度為20～25℃，光暗周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100SymbolmA@

　　mol·m2·s1，相對濕度為80%。

　　1.2總RNA的提取和反轉錄

　　采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasyPlantMiniKit按照操作說明提取大豆品種科豐34葉片總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(Merinton，美國)檢測其純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒按照反轉錄說明書合成cDNA第一條鏈。

　　1.3RLPK2全長cDNA引物設計及RTPCR基因擴增

　　利用PrimerPremier5.0軟件設計RLPK2基因的特異性引物，根據(jù)Gateway技術構建表達載體的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

　　RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

　　TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

　　RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

　　CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

　　采用高保真PhusionDNA聚合酶進行PCR擴增。反應程序：94℃預變性30s，35個循環(huán)(94℃30s，62℃30s，72℃30s)，循環(huán)結束后72℃10min延伸反應，4℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收特異性目標條帶，送樣測序，選取測序正確的克隆進行后期載體的構建。

　　1.4RLPK2過表達載體構建、擬南芥遺傳轉化及純合體篩選

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