摘要：外來(lái)植物入侵對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害極大，已成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。利用可培養(yǎng)方法，從入侵植物刺萼龍葵及其近緣非入侵植物少花龍葵體內(nèi)分別分離出11株和5株內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌種類居多，兩者共有的種類包括貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌3種;不同內(nèi)生菌在兩類植物體內(nèi)根、莖、葉不同部位分布具有一定的差異性。研究結(jié)果為闡明入侵植物刺萼龍葵的入侵機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌;植物入侵;刺萼龍葵;少花龍葵

　　外來(lái)生物入侵威脅農(nóng)田環(huán)境生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康，因此受到各國(guó)研究者的廣泛關(guān)注。刺萼龍葵(Solanum rostratum)又稱刺茄、黃花刺茄，是茄科茄屬的一種有嚴(yán)重危害的惡性植物，在我國(guó)被列為具有較大入侵危險(xiǎn)性的檢疫植物。少花龍葵(Solallum nigrum)別名白花菜，是茄科一年生草本植物，其為刺萼龍葵的近緣非入侵種。植物內(nèi)生菌與高等植物在長(zhǎng)時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化中，與植物體內(nèi)物質(zhì)或根際分泌物等相互作用，提高宿主植物養(yǎng)分吸收能力、抗逆性、抗氧化性及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力等，通過(guò)促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)來(lái)提高其入侵能力。

　　目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)刺萼龍葵的研究多集中在傳粉機(jī)制、生物學(xué)特性、萌發(fā)特性、除草劑篩選及土壤根際微生物群落的影響等方面，很少探討入侵植物和其近緣非入侵植物內(nèi)生菌多樣性的差異，以及其對(duì)植物入侵能力或過(guò)程的影響等。本課題主要通過(guò)可培養(yǎng)分離方法，探討比較入侵植物刺萼龍葵和其近緣非入侵植物少花龍葵植物內(nèi)生菌種類的差異，以揭示植物內(nèi)生菌在植物入侵過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　試驗(yàn)所用刺萼龍葵、少花龍葵種植于常熟理工學(xué)院溫室大棚內(nèi)，種植時(shí)間為2018年5月27日—8月25日，于2018年8月植株成年時(shí)期采集，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技股份有限公司;Taq酶：日本Takara(寶)生物股份有限公司。內(nèi)生菌分離選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　DHP9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司;PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)BIO-RAD公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司。

　　1.3 試驗(yàn)方法

　　1.3.1 內(nèi)生菌的分離、純化 將植株切碎塊研磨成勻漿菌懸液，依次用生理鹽水梯度稀釋，得到菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，做2個(gè)重復(fù)，進(jìn)一步培養(yǎng)觀察。根據(jù)肉眼觀察，對(duì)菌落進(jìn)行分類、標(biāo)記。多次純化直至得到單一菌落，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

　　1.3.2 基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴(kuò)增 提取內(nèi)生菌基因組總DNA，并以其為模板，采用細(xì)菌通用引物Eu-bac 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')和Eu-bac 1492R (5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3')對(duì)細(xì)菌基因組的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

　　1.3.3 菌株序列測(cè)定與比對(duì) 將內(nèi)生菌菌株送至蘇州金唯智測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，得到序列結(jié)果分別與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中親緣關(guān)系相近的菌種利用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，查找相似度最高的序列，確定菌株的分類學(xué)地位，并在此基礎(chǔ)上利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

　　2 結(jié)果與分析

　　將測(cè)得的序列與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出相似度最高的完整序列，最終歸類、確定內(nèi)生菌的種類。從刺萼龍葵中分離出11株內(nèi)生菌，其中10株為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米虎芽孢桿菌，1株為微小桿菌屬(見(jiàn)表1)。從少花龍葵分離出5株內(nèi)生菌，其中3株內(nèi)生菌為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，2株分別為泛菌屬和微桿菌屬(見(jiàn)表2)。

　　由表1和表2可知：入侵植物刺萼龍葵中內(nèi)生菌的種類多于其近緣非入侵植物少花龍葵。刺萼龍葵與少花龍葵共有的菌有3種，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌是一類植物根際促生菌，對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要作用。很多研究都從不同種類入侵植物內(nèi)分離到了芽孢桿菌。石青等人發(fā)現(xiàn)，入侵植物黃頂菊聚集對(duì)自身有益的功能性細(xì)菌(耐寒短桿菌和巨大芽孢桿菌)，并通過(guò)化感物質(zhì)直接或間接地促進(jìn)生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)一些病源微生物(尖孢鐮刀菌等)有抑制作用，從而成功入侵。以往研究顯示，貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生生防因子，防治植物病害，促進(jìn)生長(zhǎng);枯草芽孢桿菌具有促生長(zhǎng)效果和產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力;解淀粉芽孢桿菌分泌脂肽類抗菌物質(zhì)，產(chǎn)生拮抗作用，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)。這3種菌均具有抗病促生、改良土壤微環(huán)境的作用。

　　在一定程度上，刺萼龍葵體內(nèi)的內(nèi)生菌種類比少花龍葵多8種，這些內(nèi)生菌除了上述作用外，其中的賴氨酸芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌是解磷生物，可增強(qiáng)植物對(duì)磷的利用率，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微量元素及礦質(zhì)元素的吸收率，從而促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng);微小桿菌屬、耐熱芽孢桿菌可作為優(yōu)勢(shì)菌株調(diào)節(jié)菌群，降解土壤污染有機(jī)物，減少其對(duì)植株的毒害作用。此外，少花龍葵中還分離出泛菌屬、微桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬具有固氮作用，在一定程度上增強(qiáng)了少花龍葵作為本土植物的抵抗力。

　　內(nèi)生菌在植物的根、莖、葉中分布規(guī)律略有不同(見(jiàn)表3)。對(duì)于入侵植物刺萼龍葵來(lái)說(shuō)，根內(nèi)的微生物種類最多，有除微小桿菌外的10種內(nèi)生菌，莖部有4種內(nèi)生菌，葉部有3種內(nèi)生菌;貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在3個(gè)部位均有分布。對(duì)于非入侵植物少花葵來(lái)說(shuō)，根、莖和葉分別有4種、3種和2種內(nèi)生菌;貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在3個(gè)部位具有分布，而泛菌屬僅在莖部分布。與刺萼龍葵不同，解淀粉芽孢桿菌僅在少花龍葵根內(nèi)分離到。解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等多種生理活性物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)，起到促進(jìn)植物根系及植株生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗病性的作用，從而間接地減少病害。

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